PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) to metoda powszechnie wykorzystywana do amplifikacji DNA. Jej upowszechnienie stało się możliwe dzięki wprowadzeniu na rynek m.in. termostabilnej polimerazy DNA oraz termocyklera – urządzenia, które precyzyjnie i szybko zmienia temperaturę wg wcześniej ustalonego programu. W październiku 2022 r. opisano nową metodę amplifikacji DNA – SHARP (ang. SSB-Helicase Assisted Rapid PCR). Jest ona oparta na PCR, ale cała reakcja przebiega w warunkach izotermicznych, tzn. w stałej temperaturze. Na poniższym schemacie przedstawiono kolejne etapy amplifikacji DNA metodą SHARP.
W tabeli przedstawiono skład dwóch roztworów, po zmieszaniu których zachodzi amplifikacja DNA metodą SHARP. W kolejnej tabeli wyjaśniono właściwości składników oznaczonych gwiazdką (*).
Na poniższym rysunku przedstawiono dane świadczące o tym, że metoda SHARP pozwala przeprowadzić amplifikację DNA (A–D). Na rysunku A przedstawiono plazmid, który był matrycą do amplifikacji DNA o długości 1463 par zasad (pz) z użyciem starterów M13_fwd i M13_rev. Na rysunku B przedstawiono wynik SHARP w obecności wszystkich składników wymienionych w tabeli albo przy braku: ATP, SSB albo helikazy PcrA M6. Na rysunkach C i D porównano odpowiednio wynik amplifikacji DNA konwencjonalną PCR oraz SHARP w zależności od stężenia matrycowego DNA.
Jednym z niezbędnych etapów przy opracowywaniu nowej metody jest jej optymalizacja. Na poniższym rysunku przedstawiono wynik doświadczenia, w którym badano wpływ stężenia białka SSB – jednego ze składników mieszaniny do SHARP – na czułość tej metody. W tym doświadczeniu oczekiwanym produktem amplifikacji był DNA o długości 350 pz
1. Uzupełnij w poniższym tekście luki (1.–3.) wyrażeniami z tabeli, wybierając w każdym przypadku jedno z dwóch zaproponowanych.
Barwniki fluorescencyjne, takie jak EvaGreen, są wzbudzane promieniowaniem o określonej długości fali (λwz), a następnie emitują światło o charakterystycznej dla danego barwnika długości fali (λem). Użycie substancji EvaGreen w odpowiednim czytniku fluorescencyjnym pozwala na określenie ilości DNA w próbce (1) amplifikacji DNA. Zależność między λwz a λem powinna być następująca: (2). Odczynnik ten (3) konieczny do przeprowadzenia amplifikacji DNA metodą SHARP.
2. Określ, które stwierdzenia dotyczące składu ostatecznej mieszaniny do SHARP są prawdziwe, a które – fałszywe.
3. Uzupełnij w poniższym tekście luki (1.–3.) wyrażeniami z tabeli, wybierając w każdym przypadku jedno z dwóch zaproponowanych.
W metodzie SHARP do rozdzielania DNA na pojedyncze nici wykorzystywana jest energia z wiązań (1). Energia niezbędna do syntezy nowych nici DNA pochodzi z (2). Zadaniem helikazy jest zerwanie oddziaływań występujących między zasadami azotowymi (3) DNA.
4. Określ, które stwierdzenia dotyczące przedstawionych wyników badań są prawdziwe, a które – fałszywe.
