przebieg kolorymetrycznej hybrydyzacji mRNA in situ
Na poniższym schemacie przedstawiono przebieg kolorymetrycznej hybrydyzacji mRNA in situ. Ta technika pozwala wykrywać transkrypty genów bezpośrednio w badanych komórkach dzięki reakcji zachodzącej z udziałem substancji NBT+BCIP. Rozpad tej substancji pod wpływem fosfatazy alkalicznej prowadzi do strącania ciemnobrązowych lub fioletowych kryształów formazanu.
1. Przeanalizuj schemat, a następnie określ kolejność procedur niezbędnych do przeprowadzenia reakcji kolorymetrycznej hybrydyzacji mRNA in situ.
2. Sondy RNA wykorzystywane w reakcji hybrydyzacji mRNA in situ można syntezować na drodze transkrypcji fragmentu sekwencji DNA badanego genu. Reakcję transkrypcji najczęściej przeprowadza się z użyciem bakteriofagowej polimerazy RNA T7, katalizującej syntezę RNA w kierunku 5′ → 3′, która wiąże się do specyficznej sekwencji promotorowej (5′ CATAATACGACTCACTATAGGG 3′) poprzedzającej transkrybowany odcinek DNA. Jednym ze sposobów wprowadzania promotora dla polimerazy T7 do sekwencji DNA badanego genu jest dodanie go jako nawis (ang. overhang) do jednego ze starterów wykorzystywanych w reakcji PCR. Na poniższym rysunku przedstawiono jeden z możliwych schematów reakcji PCR z promotorem dla polimerazy T7 dodanym jako nawis na końcu 5′ startera FWD (ang. forward), przyłączającym się do nici antysensownej (matrycowej) badanego genu. Starter REV (ang. reverse) przyłącza się do nici sensownej (kodującej).
Określ, która kombinacja par starterów umożliwi otrzymanie matrycy DNA, z której na drodze transkrypcji z użyciem polimerazy T7 będzie można uzyskać działającą sondę RNA.
A. starter FWD z nawisem na końcu 5′ oraz starter REV B. starter FWD oraz starter REV z nawisem na końcu 5′ C. starter FWD z nawisem na końcu 3′ oraz starter REV D. starter FWD oraz starter REV z nawisem na końcu 3′
